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PKR2016--KAPA 第二代基因工程酶用戶指南

更新時(shí)間：2025-06-11 點(diǎn)擊次數(shù)：369

產(chǎn)品概述

PKR2016--KAPA 第二代基因工程酶是羅氏旗下 KAPA Biosystems 推出的高性能分子生物學(xué)工具酶系列，專為各類核酸擴(kuò)增與修飾反應(yīng)設(shè)計(jì) 。該系列酶基于先進(jìn)的蛋白質(zhì)工程技術(shù)開(kāi)發(fā)，涵蓋了 DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等多種類型，可廣泛應(yīng)用于 PCR、qPCR、二代測(cè)序（NGS）文庫(kù)構(gòu)建、cDNA 合成等科研領(lǐng)域，以的性能為科研人員提供精準(zhǔn)、高效的實(shí)驗(yàn)解決方案。

技術(shù)原理

DNA 聚合酶工作原理

KAPA 第二代 DNA 聚合酶通過(guò)定向進(jìn)化和蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造，具備的結(jié)構(gòu)與功能。其核心活性區(qū)域經(jīng)過(guò)優(yōu)化，能夠特異性識(shí)別 DNA 模板鏈，并以 dNTPs 為原料，在引物的引導(dǎo)下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，沿 5'→3' 方向合成新的 DNA 鏈。

該酶具有 3'→5' 外切酶活性，這種校對(duì)功能可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)新合成 DNA 鏈的堿基配對(duì)情況。當(dāng)遇到錯(cuò)配堿基時(shí)，3'→5' 外切酶活性會(huì)將錯(cuò)配堿基切除，然后 DNA 聚合酶繼續(xù)延伸，有效降低了 PCR 過(guò)程中的錯(cuò)誤摻入率，顯著提升擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。例如在長(zhǎng)片段 PCR 擴(kuò)增中，普通 DNA 聚合酶可能因錯(cuò)誤累積導(dǎo)致產(chǎn)物失真，而 KAPA 第二代 DNA 聚合酶憑借校對(duì)功能，能確保長(zhǎng)片段 DNA 的準(zhǔn)確擴(kuò)增。

逆轉(zhuǎn)錄酶工作原理

KAPA 第二代逆轉(zhuǎn)錄酶同樣經(jīng)過(guò)精心改造，可高效地以 RNA 為模板合成 cDNA 。它對(duì)各種復(fù)雜 RNA 結(jié)構(gòu)具有良好的耐受性，能夠克服 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙，實(shí)現(xiàn)從 5' 端到 3' 端的完整逆轉(zhuǎn)錄。

該酶具備較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在較高溫度下仍能保持活性，相比傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄酶，可采用更高的反應(yīng)溫度，減少 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的干擾，提高 cDNA 合成的效率和完整性。同時(shí)，通過(guò)優(yōu)化酶與底物的結(jié)合能力，增強(qiáng)了對(duì)低豐度 RNA 的捕獲和逆轉(zhuǎn)錄能力，適用于微量 RNA 樣本的 cDNA 合成。

產(chǎn)品特點(diǎn)

高保真性：KAPA 第二代基因工程酶的 DNA 聚合酶憑借 3'→5' 外切酶校對(duì)活性，其保真性比普通 Taq 酶高出數(shù)倍。在基因克隆、SNP 分析等對(duì)序列準(zhǔn)確性要求的實(shí)驗(yàn)中，能有效減少突變產(chǎn)生，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

高效擴(kuò)增：酶的反應(yīng)速度快，可在較短時(shí)間內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng) 。例如在 qPCR 實(shí)驗(yàn)中，能快速達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增階段，縮短實(shí)驗(yàn)周期。同時(shí)，對(duì)復(fù)雜模板（如富含 GC 區(qū)域、高 AT 區(qū)域、含有重復(fù)序列的模板）具有良好的擴(kuò)增能力，在面對(duì)具有特殊結(jié)構(gòu)的 DNA 模板時(shí)，仍能高效完成擴(kuò)增。

廣泛的應(yīng)用兼容性：適用于多種實(shí)驗(yàn)應(yīng)用場(chǎng)景，無(wú)論是常規(guī) PCR、熒光定量 PCR，還是二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、數(shù)字 PCR 等前沿技術(shù)，都能提供穩(wěn)定可靠的支持。并且兼容不同品牌和類型的 PCR 儀，方便科研人員根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有設(shè)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

低抑制劑敏感性：對(duì)常見(jiàn)的 PCR 抑制劑（如血液中的血紅蛋白、土壤中的腐殖酸、植物樣本中的多糖多酚等）具有較強(qiáng)的耐受性。在直接以臨床樣本、環(huán)境樣本等復(fù)雜樣品為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，無(wú)需繁瑣的樣本純化步驟，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，同時(shí)保證擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

穩(wěn)定的性能：采用嚴(yán)格的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制體系，確保不同批次的酶在活性、保真性和擴(kuò)增效率等方面具有高度一致性。科研人員進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)或長(zhǎng)期研究時(shí)，無(wú)需擔(dān)心因酶的批次差異影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可比性。

使用方法

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

酶的檢查與保存：收到 KAPA 第二代基因工程酶后，立即檢查包裝是否完好，確認(rèn)標(biāo)簽信息完整，包括產(chǎn)品名稱、貨號(hào)、濃度、有效期等。將酶短暫離心（低速，如 2000 - 3000 rpm，離心 1 - 2 分鐘），使附著在管蓋上的酶液集中于管底。未開(kāi)封的酶應(yīng)儲(chǔ)存于 - 20℃冰箱，避免反復(fù)凍融；開(kāi)封后的酶若短期使用（1 - 2 周），可保存于 4℃冰箱，長(zhǎng)期不用仍需放回 - 20℃冰箱。

試劑準(zhǔn)備：

緩沖液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型和酶的使用說(shuō)明，準(zhǔn)備配套的反應(yīng)緩沖液。如 PCR 反應(yīng)通常需要含有 Mg2?的緩沖液，Mg2?濃度會(huì)影響酶的活性和擴(kuò)增效果，需嚴(yán)格按照推薦濃度配制。

dNTPs：準(zhǔn)備適量的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），確保其純度和濃度準(zhǔn)確。dNTPs 濃度過(guò)高可能導(dǎo)致錯(cuò)配率上升，過(guò)低則影響擴(kuò)增效率，一般使用濃度為 200 - 250 μM。

引物：設(shè)計(jì)并合成特異性引物，引物的質(zhì)量和濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。使用前需對(duì)引物進(jìn)行濃度測(cè)定和稀釋，常規(guī) PCR 引物終濃度一般為 0.2 - 0.5 μM，qPCR 引物濃度可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化調(diào)整。

樣本準(zhǔn)備：

DNA 樣本：確保 DNA 樣本純度和濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 完整性，分光光度計(jì)測(cè)量 DNA 濃度和純度（A260/A280 比值應(yīng)在 1.8 - 2.0 之間）。若樣本存在雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、RNA 等），需進(jìn)行進(jìn)一步純化，如使用 DNA 純化試劑盒處理。

RNA 樣本：對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，RNA 樣本的質(zhì)量直接影響 cDNA 合成效果。提取的 RNA 需進(jìn)行完整性檢測(cè)（如電泳觀察 28S 和 18S rRNA 條帶）和濃度測(cè)定，盡量避免 RNA 降解。同時(shí)，需去除樣本中的基因組 DNA 污染，可采用 DNase I 處理。

實(shí)驗(yàn)操作步驟

PCR 實(shí)驗(yàn)：

反應(yīng)體系配制：在無(wú)菌 PCR 管中，按照以下順序依次加入各成分（以 50 μL 體系為例）：

10×KAPA PCR Buffer：5 μL

dNTPs Mix（2 mM）：5 μL

上游引物（10 μM）：1 μL

下游引物（10 μM）：1 μL

DNA 模板：適量（根據(jù)模板濃度調(diào)整，一般為 1 - 100 ng）

KAPA DNA 聚合酶（如 KAPA HiFi HotStart ReadyMix 中已含酶）：根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明添加

超純水：補(bǔ)足至 50 μL

混合均勻：用移液器輕輕吹打或振蕩 PCR 管，使反應(yīng)體系充分混合，短暫離心（2000 - 3000 rpm，1 - 2 分鐘），使液體集中于管底。

反應(yīng)程序設(shè)置：將 PCR 管放入 PCR 儀，設(shè)置反應(yīng)程序。一般包括預(yù)變性（95℃，3 - 5 分鐘）、變性（95℃，15 - 30 秒）、退火（根據(jù)引物 Tm 值調(diào)整，一般為 55 - 65℃，15 - 30 秒）、延伸（72℃，根據(jù)片段長(zhǎng)度調(diào)整，一般為 1 分鐘 /kb），進(jìn)行 30 - 40 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸 5 - 10 分鐘。

運(yùn)行反應(yīng)：確認(rèn) PCR 儀參數(shù)設(shè)置無(wú)誤后，啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中可通過(guò) PCR 儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)（如進(jìn)行 qPCR 時(shí)），反應(yīng)結(jié)束后，取出 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)分析，如瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物大小和產(chǎn)量。

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)：

反應(yīng)體系配制：在無(wú)菌 PCR 管中配制反應(yīng)體系（以 20 μL 體系為例）：

5×KAPA RT Buffer：4 μL

dNTPs Mix（10 mM）：1 μL

Random Hexamers 或 Oligo (dT) 引物（10 μM）：1 μL

RNA 模板：適量（根據(jù) RNA 濃度調(diào)整，一般為 1 - 1000 ng）

KAPA Reverse Transcriptase：1 μL

RNase - free Water：補(bǔ)足至 20 μL

混合均勻：充分混勻反應(yīng)體系后，短暫離心。

反應(yīng)程序設(shè)置：將 PCR 管放入 PCR 儀，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序。一般為 25℃孵育 5 分鐘（引物退火）、42℃孵育 30 - 60 分鐘（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）、85℃孵育 5 分鐘（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）。

后續(xù)處理：逆轉(zhuǎn)錄完成后，得到的 cDNA 可直接用于后續(xù)的 PCR、qPCR 等實(shí)驗(yàn)，或儲(chǔ)存于 - 20℃冰箱備用。

實(shí)驗(yàn)后處理

產(chǎn)物分析：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢?duì) PCR 或逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分析。如通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察產(chǎn)物條帶大小和亮度，判斷擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄是否成功；進(jìn)行測(cè)序分析，驗(yàn)證產(chǎn)物序列的準(zhǔn)確性；使用 qPCR 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析等。

廢棄物處理：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的含有酶、試劑、樣本的廢棄物，應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室生物安全和化學(xué)廢棄物處理規(guī)定進(jìn)行分類處理。對(duì)于含有 DNA 或 RNA 的樣本，需進(jìn)行高壓滅菌或化學(xué)消毒處理后再丟棄，防止生物污染。

酶的保存：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剩余的酶按照規(guī)定的儲(chǔ)存條件保存。若酶液出現(xiàn)渾濁、沉淀等異常現(xiàn)象，可能已變質(zhì)，應(yīng)停止使用并更換新酶。

注意事項(xiàng)

酶的使用：

從冰箱取出酶后，應(yīng)立即置于冰上操作，避免在室溫下長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致酶活性下降。使用時(shí)，采用 “冰上配制反應(yīng)體系" 的方式，最后加入酶并迅速混勻，減少酶暴露在常溫下的時(shí)間。

嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)推薦的用量使用酶，過(guò)量使用酶可能會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，而用量不足則可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率低下。

不同類型的 KAPA 基因工程酶有各自的適用范圍和最佳反應(yīng)條件，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，務(wù)必仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，了解酶的特性和使用要求。

反應(yīng)體系優(yōu)化：

引物設(shè)計(jì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一，需遵循引物設(shè)計(jì)原則，確保引物的特異性和有效性。在進(jìn)行新的實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出最佳引物對(duì)。

反應(yīng)體系中的 Mg2?濃度、dNTPs 濃度、引物濃度等參數(shù)可能需要根據(jù)具體模板和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行優(yōu)化。可通過(guò)梯度實(shí)驗(yàn)，探索各參數(shù)的最佳組合，以獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

對(duì)于復(fù)雜模板或擴(kuò)增難度較大的片段，可嘗試添加輔助試劑（如甜菜堿、DMSO 等），改善擴(kuò)增效果，但需注意輔助試劑的濃度可能會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響，需謹(jǐn)慎優(yōu)化。

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范：

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，使用無(wú)菌的 PCR 管、移液器吸頭、試劑等，避免外源核酸污染，防止假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn) 。

操作過(guò)程中，盡量減少反應(yīng)體系暴露在空氣中的時(shí)間，避免水分蒸發(fā)和試劑揮發(fā)，影響反應(yīng)體系的準(zhǔn)確性。

對(duì)于需要多次使用的試劑（如 dNTPs Mix、引物等），應(yīng)進(jìn)行分裝保存，避免反復(fù)凍融，防止試劑降解影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

安全防護(hù)：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的酶、試劑等可能具有一定的毒性或刺激性，操作時(shí)需佩戴手套、口罩等防護(hù)裝備。如不慎接觸到皮膚或眼睛，應(yīng)立即用大量清水沖洗，并根據(jù)情況就醫(yī)。同時(shí)，注意實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，防止有害氣體積聚。

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物：

原因：可能是引物設(shè)計(jì)不合理、模板質(zhì)量不佳、酶活性喪失、反應(yīng)體系成分缺失或濃度不當(dāng)、反應(yīng)程序設(shè)置錯(cuò)誤等。

解決方法：重新設(shè)計(jì)引物，通過(guò) BLAST 等工具驗(yàn)證引物特異性；對(duì)模板進(jìn)行純化或重新提取，確保模板質(zhì)量；檢查酶的儲(chǔ)存條件和有效期，確認(rèn)酶活性正常；仔細(xì)核對(duì)反應(yīng)體系成分，確保各成分添加準(zhǔn)確且濃度合適；檢查 PCR 儀反應(yīng)程序設(shè)置，如預(yù)變性、退火、延伸溫度和時(shí)間是否正確，必要時(shí)進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。

非特異性擴(kuò)增：

原因：引物濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低、Mg2?濃度過(guò)高、酶用量過(guò)多、模板雜質(zhì)過(guò)多等。

解決方法：降低引物濃度，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；提高退火溫度，通過(guò)梯度 PCR 確定最佳退火溫度；適當(dāng)降低 Mg2?濃度；減少酶的用量；對(duì)模板進(jìn)行進(jìn)一步純化，去除雜質(zhì)干擾。

擴(kuò)增效率低：

原因：模板濃度過(guò)低、引物效率低、dNTPs 濃度不足、酶活性下降、反應(yīng)時(shí)間不足等。

解決方法：增加模板上樣量；優(yōu)化引物設(shè)計(jì)或更換引物；檢查 dNTPs 濃度，確保其充足；確認(rèn)酶的儲(chǔ)存和使用條件，必要時(shí)更換新酶；適當(dāng)延長(zhǎng)延伸時(shí)間或增加循環(huán)次數(shù) 。

逆轉(zhuǎn)錄效率低：

原因：RNA 模板質(zhì)量差、逆轉(zhuǎn)錄引物選擇不當(dāng)、逆轉(zhuǎn)錄酶活性不足、反應(yīng)溫度不合適等。

解決方法：重新提取高質(zhì)量的 RNA 模板，避免 RNA 降解；根據(jù) RNA 樣本類型選擇合適的引物（如 Random Hexamers 適用于各種 RNA，Oligo (dT) 適用于真核 mRNA）；檢查逆轉(zhuǎn)錄酶的儲(chǔ)存條件和有效期，確保酶活性正常；優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，可嘗試提高或降低反應(yīng)溫度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn) 。

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