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樣品制備環(huán)節(jié)：蛋白質(zhì)未提取或降解（未加蛋白酶抑制劑）、樣品上樣量不足（低于檢測下限，如目標(biāo)蛋白含量＜1 pg）；
電泳環(huán)節(jié)：凝膠濃度不匹配（如檢測 20 kDa 小蛋白用 10% 凝膠，蛋白跑出色譜膠）、電泳時(shí)間過長（蛋白遷移至凝膠外）；
轉(zhuǎn)膜環(huán)節(jié)：轉(zhuǎn)膜方向反了（蛋白未轉(zhuǎn)移到膜上，仍留在凝膠中）、轉(zhuǎn)膜效率低（如 PVDF 膜未用甲醇激活，無法吸附蛋白）；
免疫反應(yīng)環(huán)節(jié)：一抗與目標(biāo)蛋白不匹配（如用兔抗小鼠蛋白抗體檢測人源樣本）、一抗?jié)舛冗^低（如 1:10000 稀釋導(dǎo)致結(jié)合不足）、抗體失效（反復(fù)凍融或過期）；
信號(hào)檢測環(huán)節(jié)：ECL 底物過期（發(fā)光效率下降）、成像時(shí)間過短（未捕獲到弱信號(hào)）。
樣品制備排查：
用 BCA 法（如羅氏 BCA Protein Assay Kit）檢測蛋白質(zhì)濃度，確保上樣量≥20 μg（或目標(biāo)蛋白含量≥1 pg）；
提取時(shí)添加新鮮的蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail，含 6 種抑制劑，可抑制絲氨酸 / 半胱氨酸蛋白酶等），避免蛋白質(zhì)降解；
電泳與轉(zhuǎn)膜驗(yàn)證：
根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇凝膠濃度（參考：10-50 kDa 用 15% 凝膠，50-100 kDa 用 10% 凝膠，100-200 kDa 用 8% 凝膠），電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色凝膠，確認(rèn)蛋白已進(jìn)入凝膠且未跑穿；
轉(zhuǎn)膜前用甲醇浸泡 PVDF 膜 10 秒（激活羥基），轉(zhuǎn)膜后用麗春紅 S 染色膜，觀察是否有蛋白質(zhì)條帶（若有則證明轉(zhuǎn)膜成功，無則檢查轉(zhuǎn)膜方向或緩沖液）；
免疫反應(yīng)優(yōu)化：
核對(duì)一抗說明書，確認(rèn)種屬匹配（如檢測人 EGFR 需用抗人 EGFR 抗體，而非抗小鼠 EGFR），優(yōu)先選擇經(jīng)過驗(yàn)證的單克隆抗體（如羅氏 Anti-EGFR Monoclonal Antibody，經(jīng) WB 驗(yàn)證，特異性＞99%）；
調(diào)整一抗?jié)舛龋ㄍ扑]起始濃度 1:1000-1:5000），4℃孵育過夜（延長結(jié)合時(shí)間），洗膜時(shí)用 TBST 緩沖液（含 0.1% Tween-20）充分洗滌（3 次 ×15 分鐘），避免未結(jié)合抗體殘留；
信號(hào)檢測保障：
使用新鮮的 ECL 底物（如羅氏 Lumi-Light™ Plus Substrate，發(fā)光時(shí)間長達(dá) 8 小時(shí)），先進(jìn)行 5 分鐘預(yù)曝光，若信號(hào)弱則延長至 10-30 分鐘，或使用高靈敏度成像儀（如羅氏 ChemiDoc™ MP Imaging System，檢測下限達(dá) 0.1 pg）。
樣品制備：蛋白質(zhì)未充分變性（如 SDS 上樣緩沖液未加 β- 巰基乙醇，或加熱時(shí)間不足）、樣品中含大量雜質(zhì)（如鹽濃度過高，導(dǎo)致電泳時(shí)蛋白遷移不均）；
電泳環(huán)節(jié)：凝膠聚合不均（APS 或 TEMED 添加量不足，導(dǎo)致凝膠孔徑不一致）、電泳緩沖液反復(fù)使用（離子濃度下降，導(dǎo)電性減弱）；
轉(zhuǎn)膜環(huán)節(jié)：轉(zhuǎn)膜電流過大（膜發(fā)熱導(dǎo)致蛋白擴(kuò)散）、凝膠與膜之間有氣泡（局部轉(zhuǎn)膜不，條帶斷裂）。
樣品處理優(yōu)化：
確保上樣緩沖液中 β- 巰基乙醇終濃度為 5%，95℃加熱 10 分鐘（而非 5 分鐘），使蛋白質(zhì)變性（線性化）；
若樣品鹽濃度高（如從高鹽緩沖液中提取），用透析袋（截留分子量 3 kDa）透析 24 小時(shí)（換液 3 次），或使用脫鹽柱（如羅氏 HiTrap™ Desalting Columns）去除鹽分；
電泳條件控制：
使用新鮮配制的電泳緩沖液（Tris - 甘氨酸 - SDS 緩沖液，pH 8.3），避免反復(fù)使用（建議使用次數(shù)≤3 次）；
選擇預(yù)制膠（如羅氏 ExcelGel™ SDS 預(yù)制膠，工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，孔徑均勻性 CV 值＜5%），避免手動(dòng)制膠導(dǎo)致的聚合不均；
轉(zhuǎn)膜操作規(guī)范：
采用恒壓轉(zhuǎn)膜（而非恒流），根據(jù)膜面積調(diào)整電壓（如 7 cm×8 cm 膜用 25 V 轉(zhuǎn)膜 30 分鐘），轉(zhuǎn)膜時(shí)在冰浴中進(jìn)行（避免膜發(fā)熱）；
鋪膜時(shí)用玻璃棒輕輕滾動(dòng)，排除凝膠與膜之間的氣泡（可在膜上滴加少量轉(zhuǎn)膜緩沖液，幫助氣泡排出）。
蛋白質(zhì)修飾影響：目標(biāo)蛋白存在翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化、泛素化），導(dǎo)致分子量增大（如未磷酸化的 ERK 分子量約 42 kDa，磷酸化后因電荷變化，遷移速度減慢，條帶偏移至 45 kDa 左右）；
電泳參數(shù)偏差：凝膠濃度錯(cuò)誤（如檢測 40 kDa 蛋白用 15% 凝膠，而非 10%，導(dǎo)致蛋白遷移過快，條帶分子量偏小）、電泳電壓過高（遷移速度加快，條帶位置偏上）；
樣品降解：蛋白質(zhì)部分降解（如提取后未及時(shí)檢測，導(dǎo)致 C 端或 N 端片段斷裂），出現(xiàn) “小分子量雜帶"，誤判為目標(biāo)條帶。
修飾驗(yàn)證：
若懷疑磷酸化修飾，可同時(shí)檢測磷酸化與非磷酸化形式（如用羅氏 Anti-p-ERK 與 Anti-ERK 抗體，前者條帶偏移，后者為標(biāo)準(zhǔn)分子量）；
若為糖基化修飾，用糖苷酶（如 PNGase F）處理樣品（37℃孵育 1 小時(shí)），去除糖鏈后再電泳，觀察條帶是否恢復(fù)至預(yù)期分子量；
電泳參數(shù)校準(zhǔn)：
嚴(yán)格按照目標(biāo)蛋白分子量選擇凝膠濃度（參考表 1），并使用蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（如羅氏 Precision Plus Protein™ Standards，含 10 種蛋白，分子量 10-250 kDa），每次實(shí)驗(yàn)均上樣標(biāo)準(zhǔn)品，校準(zhǔn)條帶位置；
控制電泳電壓（濃縮膠 80 V，分離膠 120 V），避免電壓過高（如 150 V）導(dǎo)致遷移速度異常；
降解防控：
蛋白質(zhì)提取后立即進(jìn)行電泳（或 - 80℃分裝保存，避免反復(fù)凍融），若需長期保存，添加蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Mini EDTA-free，適合金屬蛋白酶抑制）。
目標(biāo)蛋白分子量（kDa） | 推薦凝膠濃度（%） | 電泳時(shí)間（分離膠，120 V） |
10-50 | 15 | 40-50 分鐘 |
50-100 | 10 | 60-70 分鐘 |
100-200 | 8 | 80-90 分鐘 |
封閉不充分：封閉液選擇錯(cuò)誤（如檢測磷酸化蛋白用脫脂牛奶，牛奶中內(nèi)源性磷酸酶與抗體交叉反應(yīng)）、封閉時(shí)間過短（如室溫孵育 30 分鐘，覆蓋非特異性位點(diǎn)）；
抗體非特異性結(jié)合：一抗?jié)舛冗^高（如 1:500 稀釋，導(dǎo)致非特異性結(jié)合增多）、二抗與膜或封閉液成分交叉反應(yīng)（如用羊抗兔二抗檢測兔源封閉蛋白）；
試劑污染：ECL 底物污染（如混入雜質(zhì)，導(dǎo)致非特異性發(fā)光）、膜被熒光物質(zhì)污染（如戴手套接觸膜，手套上的熒光劑殘留）。
封閉條件優(yōu)化：
根據(jù)檢測目標(biāo)選擇封閉液（參考表 2），如檢測磷酸化蛋白或生物素標(biāo)記抗體，優(yōu)先用 3% BSA（如羅氏 Albumin from Bovine Serum，無內(nèi)源性磷酸酶與生物素），避免用脫脂牛奶；
延長封閉時(shí)間（室溫 2 小時(shí)或 4℃過夜），封閉過程中持續(xù)搖床振蕩（50 rpm），確保封閉液均勻覆蓋膜表面；
抗體濃度調(diào)整：
降低一抗?jié)舛龋ㄈ鐝?1:500 調(diào)整為 1:2000），并進(jìn)行梯度稀釋實(shí)驗(yàn)（1:1000、1:2000、1:5000），選擇 “條帶清晰且背景低" 的最佳濃度；
選擇交叉反應(yīng)率低的二抗（如羅氏 HRP-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG，經(jīng)親和純化，與小鼠 IgG 交叉反應(yīng)率＜0.5%），二抗?jié)舛瓤刂圃?1:5000-1:10000；
污染防控：
使用新鮮開封的 ECL 底物，避免反復(fù)使用（單次使用后丟棄剩余底物）；
操作時(shí)戴無粉手套，避免用手直接接觸膜（可使用鑷子夾取膜邊緣），膜的存放環(huán)境避免熒光燈直射（防止熒光物質(zhì)激發(fā)）。
抗體特異性差：一抗為多克隆抗體（識(shí)別多個(gè)表位，與同源蛋白交叉反應(yīng)）、一抗與樣品中其他蛋白有同源序列（如檢測 EGFR 時(shí)，與 ERBB2 蛋白交叉反應(yīng)）；
蛋白降解或聚合：樣品中目標(biāo)蛋白部分降解（產(chǎn)生小分子量片段，形成雜帶）、蛋白質(zhì)聚合（如加熱不充分，形成二聚體 / 三聚體，出現(xiàn)大分子量雜帶）；
轉(zhuǎn)膜污染：轉(zhuǎn)膜時(shí)凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到膜的非預(yù)期區(qū)域（如相鄰泳道的蛋白擴(kuò)散，形成橫向雜帶）。
抗體選擇優(yōu)化：
優(yōu)先使用單克隆抗體（如羅氏 Anti-KRAS Monoclonal Antibody，僅識(shí)別 KRAS 蛋白的特定表位，交叉反應(yīng)率＜0.1%），避免使用多克隆抗體；
查閱抗體說明書，確認(rèn)是否有 WB 驗(yàn)證數(shù)據(jù)（如是否標(biāo)注 “僅在 42 kDa 處出現(xiàn)單一條帶"），選擇經(jīng)過同行評(píng)審的抗體；
樣品處理改進(jìn)：
提取后立即添加蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail），并在 - 80℃分裝（避免反復(fù)凍融導(dǎo)致降解）；
確保上樣緩沖液中 SDS 濃度為 2%，95℃加熱 10 分鐘，使蛋白質(zhì)解聚（避免二聚體形成）；
轉(zhuǎn)膜與電泳控制：
上樣時(shí)避免樣品溢出（每個(gè)泳道上樣量不超過泳道體積的 80%），電泳時(shí)使用新鮮緩沖液，避免蛋白擴(kuò)散；
轉(zhuǎn)膜后用麗春紅 S 染色，確認(rèn)相鄰泳道無蛋白交叉污染，若有則增加泳道間距或降低上樣量。
目標(biāo)蛋白豐度低：樣品中目標(biāo)蛋白含量低于檢測下限（如＜0.1 pg）、樣品上樣量不足（如僅上樣 5 μg 蛋白）；
抗體親和力低：一抗與目標(biāo)蛋白的親和力常數(shù)（KD）過大（如＞10?? mol/L，結(jié)合能力弱）、二抗偶聯(lián)效率低（如酶與抗體的偶聯(lián)比例 DOL＜1，信號(hào)放大不足）；
檢測系統(tǒng)靈敏度低：ECL 底物發(fā)光效率低（如普通底物，而非增強(qiáng)型）、成像儀檢測限高（如無法捕獲皮克級(jí)信號(hào)）。
樣品富集與上樣優(yōu)化：
若目標(biāo)蛋白豐度低（如血清中的細(xì)胞因子），使用免疫沉淀（IP）富集（如羅氏 Protein G Sepharose™ 4 Fast Flow，特異性結(jié)合抗體 - 抗原復(fù)合物），富集后再進(jìn)行 WB 實(shí)驗(yàn)；
增加上樣量（如從 10 μg 增至 30 μg），但需注意避免過載（導(dǎo)致條帶飽和，影響定量）；
抗體與底物選擇：
選擇高親和力一抗（如羅氏 Anti-p53 Antibody，KD=10?12 mol/L，結(jié)合能力是普通抗體的 1000 倍），二抗選擇高偶聯(lián)效率的產(chǎn)品（如羅氏 HRP-Conjugated 二抗，DOL=2-3）；
使用增強(qiáng)型 ECL 底物（如羅氏 Lumi-Light™ Plus Substrate，發(fā)光強(qiáng)度是普通底物的 5 倍），延長曝光時(shí)間（如從 1 分鐘增至 10 分鐘）；
檢測儀器升級(jí)：
使用高靈敏度成像儀（如羅氏 ChemiDoc™ MP Imaging System，配備高分辨率 CCD 相機(jī)，檢測下限達(dá) 0.1 pg），避免使用 X 光片（曝光時(shí)間固定，難以捕捉弱信號(hào)）。
操作不標(biāo)準(zhǔn)化：上樣量不一致（如手動(dòng)加樣時(shí)，每孔體積偏差＞1 μL）、孵育時(shí)間 / 溫度波動(dòng)（如一次 4℃過夜，一次室溫 2 小時(shí)）；
試劑批次差異：不同批次的一抗親和力不同（如多克隆抗體制備過程中，批次間特異性差異）、ECL 底物發(fā)光效率波動(dòng)（如不同批次的底物活性差異）；
儀器未校準(zhǔn)：成像儀的灰度值檢測未校準(zhǔn)（如每次實(shí)驗(yàn)的曝光參數(shù)不同，導(dǎo)致灰度值無法比較）、分析軟件參數(shù)設(shè)置不一致（如閾值選擇不同）。
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